气相色谱法测定浓香型白酒中大曲酯化力

大曲是生产浓香型大曲酒的关键，大曲质量的好坏直接影响到酒的质量。因此，大曲在白酒酿造过程中扮演着至关重要的角色，对白酒风味的形成有着深远的影响。大曲主要以小麦、大麦、豌豆等富含淀粉和蛋白质的粮食为原料，经过加水混捏、压制成曲坯，再在人工控制的温度和湿度下网罗环境微生物自然发酵而成。大曲中含有一种既能催化酯的合成，又能催化酯的分解的微生物酶——酯酶，是催化合成低级脂肪酸酯酶类的总称，业内习惯称为酯化酶和酯分解酶。在白酒的酿造工艺中，酯化酶起到了催化剂的关键作用，促进了酸和醇的结合脱水反应，生成了白酒香气的主要成分——酯。大曲的酯化力来源于大曲中的酯化酶，是将醇和酸酯化成酯的能力。传统的酯化力测定方法，是利用皂化反应和反滴定来测定。此方法存在操作繁琐、耗时长等缺点，难以满足现代化生产需求。随着分析技术的进步，气相色谱法为大曲检测带来了全新解决方案。该方法通过直接测定酯化反应产物的含量，实现了三大技术突破。首先，简化前处理流程，省去复杂回流步骤；其次，提升检测效率，单次分析时间缩短60%；最重要的是，数据准确性显著提高，检测精密度可达1.5%以内。技术改进不仅停留在实验室层面，更通过与信息化系统的深度融合，为构建智能检测体系奠定了基础。检测仪器不仅能够自动输出标准化数据，还能与实验室信息管理系统无缝对接。这一变革彻底改变了传统实验室的工作模式，实现数据实时上传、结果自动分析、报告一键生成，大大减少了人为误差，提高了实验效率。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品、试剂

自制浓香型大曲；己酸乙酯标准品，纯度99.76%,DR Ehrenstorfer；乙酸正戊酯标准品，纯度99.5%，北京北方伟业计量技术研究院；乙醇，色谱纯，纯度90%，霍尼威尔贸易上海有限公司；己酸标准品，纯度99.5%，北京北方伟业计量技术研究院；乙醇溶液，60%体积分数，用色谱纯乙醇加超纯水配制。

己酸乙酯标准溶液：根据需要称取一定量的标准物质己酸乙酯，用容量瓶定容。重复操作用乙醇溶液配制5个不同浓度的标准溶液（要求标准溶液的浓度线性范围可包含样品测量范围）。

乙酸正戊酯溶液：用万分之一天平在8.750～9.000 g之间准确称取一定量乙酸正戊酯精确至小数点后四位，用500 mL容量瓶定容，摇匀，配制成内标溶液。

1.1.2 仪器设备

气相色谱仪，氢火焰离子化检测器，7890A，美国安捷伦科技有限公司；7693自动进样器；恒温培养箱；电子天平，SQP，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GC ChemStation工作站；超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；容量瓶、吸量管；微量注射器：5μL。

1.2 气相色谱条件

色谱柱：DB-WAX 122-7032UI (30 m×250μm×0.25μm），美国安捷伦科技有限公司；进样量：0.1μL；载气（高纯氮）：流速1 mL/min；分流比：20∶1；氢气：30 mL/min；空气：300 mL/min；进样口温度：250℃；检测器温度：300℃；柱温：初温39℃，保持4 min，以10℃/min升到80℃，以40℃/min升到120℃，保持3 min，再以30℃/min升到200℃，保持3.5 min。

载气、氢气和空气的流量参数需根据仪器型号和分析要求进行优化调整。实验过程中应通过系统性的条件筛选，确定蕞佳流速配比，以确保内标物峰与目标分析物峰之间达到基线分离，同时保证各色谱峰具有良好的峰形和分离度。

1.3 实验方法

1.3.1 校正因子的测定

采用移液管准确量取10.00 mL各浓度标准溶液，分别置于具塞比色管中，精确加入0.20 mL内标溶液，充分混匀。待气相色谱系统基线平稳后进样分析，记录己酸乙酯和内标物的特征保留时间及相应色谱峰面积，然后在脱机工作站中的校正表里制作己酸乙酯标准曲线，得到己酸乙酯的相对校正因子。

1.3.2 样品制备

1.3.2. 1 酯化样品的制备

向250 mL锥形瓶中依次加入1.5 mL己酸、25 mL无水乙醇和75 mL蒸馏水，确保所有成分充分混合均匀。精确称量相当于绝干试样量的25 g物质，精确到小数点后两位，将其加入锥形瓶中。摇匀锥形瓶内的溶液，并用塞子紧密封闭瓶口。将封闭的锥形瓶置于设定为35℃的恒温箱内，进行为期7 d的保温酯化处理。同时进行空白试验作为参考。

1.3.2. 2 蒸馏

将经过7 d酯化反应后的试样溶液全部倒入250 mL蒸馏瓶中。用量筒量取50 mL浓度为30%的乙醇溶液，分次清洗锥形瓶后倒入蒸馏瓶。准备一个50 mL容量瓶，将蒸馏装置置于冰水浴中进行冷却，以便冷凝收集馏出液。加热蒸馏瓶直至馏出液液面接近容量瓶标线时停止加热，随后取下容量瓶。待馏出液温度降至20℃时，用蒸馏水定容至刻度线，充分摇匀混合，以备后续使用。

1.3.3 样品测定

用移液管吸取10 mL样品于具塞比色管中，准确加入0.20 mL内标溶液，混匀后采用与标准曲线完全相同的色谱条件进行分析，通过比对保留时间（±0.05 min）确认己酸乙酯色谱峰位置，在脱机工作站中用制作好的标准曲线查看报告单即可显示己酸乙酯的含量。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围及检出限

仪器参数经优化调整后达到稳定工作状态，根据1.1.1配制系列己酸乙酯标准溶液，浓度为0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L，经气相色谱分析获得相应峰面积数据，以浓度为自变量（x）、峰面积为因变量（y）进行线性回归分析，标准工作曲线见图1、图2。结果表明，己酸乙酯在一定浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.998，加入蕞低可接受浓度的样品空白独立测试20次，计算出标准偏差SA见式（1），在99%的置信概率下，方法检出限=3SA/b(b为标准曲线的斜率）。以10倍检出限确定方法的定量限，结果见表1。

在与测量标准曲线完全相同的条件下，对一低浓度样品进行20次测量，并按下列公式计算：

      式中：SA——标准偏差；I0i——单次测量值；I0——测量平均值；n——测量次数。

2.2 方法的正确度试验

在阴性样品中加入标准品进行实验，加入低浓度、中浓度和高浓度的标准品，最终样品的浓度分别为0.5 g/L、2.0 g/L和4.0 g/L。由表2可知，该方法在不同加标水平下，其均值与加标浓度比较，测定含量的偏差在1.32%～3.48%之间，绝对偏差小于10%，满足重复性的实验要求。

2.3 方法的精密度试验

准确称取绝干大曲25 g，按照确认的检测方法重复测量6次，计算己酸乙酯的含量及其相对标准偏差，结果如表3所示。对己酸乙酯精密度试验所得数据进行分析处理，可得RSD=0.93%。试验表明，测定己酸乙酯含量的方法具有较好的再现性。

2.4 加标回收试验

以经1.3.2中前处理方法处理后的样品为本底和空白样品，另外取3份分别准确加入1.0 g/L、2.0 g/L和3.0 g/L的己酸乙酯标准溶液进行加标回收实验。按1.3.3处理后上气相色谱分析，进行回收率计算，测试结果见表4。从表4可看出，在未知样品中加入已知浓度的己酸乙酯标准品的回收率较好，浓度回收率分别为100.28%、100.27%、99.47%，均满足回收率要求。

2.5 方法等效性验证

本研究通过对比试验验证气相色谱法测定大曲酯化力的可行性。根据方法学验证要求，新方法需与现行行业标准QB/T 4257—2011进行比对，并通过统计学检验判定其等效性。

2.5.1 实验室间比对

将3份不同样品分别派发给6个有资质的实验室进行气相色谱法和行业标准法的大曲酯化力（以己酸乙酯计）测定，结果见表5。

结果显示，两种方法的精密度均符合检测要求（RSD<5%），且气相色谱法表现出更好的重复性。

2.5.2 统计学分析

在95%置信水平下进行双尾t检验，结果见表6。

查表得临界值t(0.05/2,10)=±2.228，计算得t值均小于t(0.05/2,10)，且p>0.05，表明两种方法的测定结果无显著性差异。

3 结论

气相色谱法具有优于行业标准法的精密度。t检验结果表明，两种方法测定结果具有等效性；在95%置信水平下，气相色谱法可作为行业标准方法的替代方案。本研究为建立大曲酯化力检测的新方法提供了可靠的科学依据。

气相色谱法作为大曲酯化力检测的新兴技术，在白酒行业具有广阔的应用前景，其灵敏度高、结果准确，可同时测定多种酯类，有望成为行业标准方法，替代传统皂化法，推动建立统一的大曲质量评价体系；智能化方面与LIMS系统深度集成，实现检测全流程自动化，结合AI算法开发智能判读系统；在工艺优化方面，为制曲工艺参数优化提供了数据支撑，实现发酵过程精准调控；质量追溯方面，可以建立大曲“指纹图谱”数据库，完善产品质量溯源体系。

在大曲酯化力测定过程中，气相色谱分析条件的差异会直接影响测定结果的准确性。由于各企业使用的仪器型号和参数设置不尽相同，可能导致测定数据出现偏差。因此，色谱条件的优化也是决定结果准确率的重要条件。

近年来，酶在有机相中的生物催化作用因潜在的工业价值而越来越受到人们的重视，目前传统的样品前处理过程耗时过长，是否可以考虑通过用有机相代替水相、调整底物浓度、优化酸醇比例、加曲量控制、反应温度梯度测试等来缩短检测时长，有待进一步探讨。

大曲中的酯化酶具有独特的双向催化特性，既能催化酸与醇的酯化反应，又能催化酯类物质的水解反应，直接影响白酒发酵过程中风味物质的动态平衡，但目前行业标准仅检测酯化力，忽略了酯分解能力的测定，导致对大曲质量的评价存在局限性，为了结果的准确性，在测定酯化力的同时还应检测酯的分解能力。

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